Реакция торможения гемагглютинации в вирусологии. Реакция непрямой гемагглютинации Анализ крови на ви гемагглютинации

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита - эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+». Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл"1-2% взвеси эритроцитов.

Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.

Постановка реакции. Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.

Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.

Контрольные вопросы.

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что" специфический комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РКС-сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.

Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к. нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").

Компоненты, реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен,

реже взвесь микроорганизмов.

2. Антитело - сыворотка больного.

3. Комплемент - сыворотка морских свинок.

4. Антиген - эритроциты барана.

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана.

6. Изотонический раствор.

Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,

они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Реакция гемагглютинации (РГА)

РГА основана на том, что некоторые виды бактерий и вирусов обладают способностью адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных (и птиц), вызывая их склеивание и образование агглютината (прямая РГА).

Адсорбция антигена (бактерий, вирусов) на поверхности эритроцитов не всегда проявляется образованием видимого осадка; кроме того, РГА неспецифична, потому что эритроциты одного и того же вида животного могут адсорбировать различные антигены.

Специфической является реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). Для ее постановки предварительно готовят эритроцитарный диагностикум (эритроциты, на которых адсорбирован антиген). С этой целью стерильно получают кровь барана (или петуха), дефибринируют ее и несколько раз отмывают в фосфатно-буферном растворе (pH 7,2) с помощью 3-5-кратного центрифугирования. Над- осадочную жидкость удаляют, концентрацию эритроцитов доводят до 2,5% (1:40). К 2,5%-й взвеси эритроцитов добавляют в равном объеме (по 1 мл или по 0,5 мл) взвесь бактерий исследуемого вида микроба в концентрации 5-10 млрд клеток в 1 мл. Эритроциты легко адсорбируют антиген полисахаридной природы. Для адсорбции антигена белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином в разведении 1:20 000. Эритроциты в комплексе с добавленным антигеном оставляют для сенсибилизирования (адсорбции) на 2 ч в термостате (37 °С), затем вновь центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин в течение 5 мин с фосфатно-буферным раствором (рис. 9.13).

Полученный эритроцитарный диагностикум помещают в пробирки (или лунки в плексигласовой доске) и добавляют к нему стандартную иммунную сыворотку.

В положительных случаях произойдет РГА - выпадение эритроцитов в виде характерного хлопьевидного или зернистого осадка, распределенного по всей поверхности дна пробирки (гемагглютинат). Значит, исследуемый вид микроба (антиген) специфичен антителам иммунсыворотки. В отрицательных случаях несклеенные эритроциты осядут на дно в виде небольшого ровного кружочка.

Для большей достоверности результатов РПГА проводят реакцию задержки (торможения) феномена гемагглютинации (РЗГА) или ее модификацию - реакцию нейтрализации антител (РИА).

Рис. 9.13. Реакция пассивной гемагглютинации (схема): Эр - эритроциты: АГ - антиген: АТ - антитело

Сущность РЗГА заключается в том, что реакцию агглютинации ставят со специфической диагностической сывороткой и испытуемым антигеном (исследуемый вид микроба используют как антиген). Эту смесь выдерживают 1-2 ч при 37 °С, затем добавляют эритроциты. Если испытуемый антиген гомологичен антителам диагностической сыворотки, они взаимодействуют друг с другом и добавленные эритроциты не агглютинируют - результат реакции положительный. Если испытуемый антиген не гомологичен антителам сыворотки или он не содержится в материале, то добавленные эритроциты адсорбируют антиген и происходит РГА - результат РЗГА отрицательный, вид испытуемого микроба (антигена) не установлен.

Методика постановки PH А заключается в том, что берут в равных объемах и смешивают диагностическую иммунную сыворотку с различными разведениями исследуемого материала (искомого антигена), оставляют для контакта на 1-2 ч, затем добавляют эритроциты, сенсибилизированные определенным (известным) антигеном, специфическим по отношению к антителам сыворотки (эритроцитарный диагностикум). Когда искомый антиген вступает в реакцию с антителами сыворотки, происходит их нейтрализация и добавленные эритроциты не агглютинируют, РГА не происходит - результат РНА положительный. Если в исследуемом материале не содержится антиген, специфический к антителам используемой сыворотки, нейтрализации антител не будет. Поэтому при добавлении эритроцитарного диагнос- тикума проявляется агглютинация эритроцитов (гемагглютинация), а результат РНА - отрицательный. Реакция нейтрализации антител - высокочувствительный метод обнаружения антигена не только во взвеси живых (или убитых) бактерий, но и во взвеси растертой ткани различных органов, нативных и гретых секретах и экскретах больного организма.

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

1.Реакция гемагглютинации

(РГА)

метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на наличии у некоторых вирусов способности избирательно агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

В основе РГА лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию. При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

Использование РГА

РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемагглютинирующих единиц - АЕ).

Адсорбция вирусов

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок.

Антиген для РГА

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, материал из зараженных КЭ, культур ткани и др.), в котором предполагается наличие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Постановка ориентировочной РГА

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю вирусосодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой.

Оценка реакции РГА

Оценивают реакцию в крестах (плюсах). При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осадка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробирки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста

2. Реакция торможения гемагглютинации - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами). Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической вирусологии для определения титров специфических антител к тем или иным вирусам, а также для серологической идентификации и типирования изолятов вирусов из клинического материала от больных. Используют несколько ограничено в силу наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных антител - агглютининов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Несмотря на своё название, принцип реакции во многом аналогичен РН вирусов, так как основан на способности AT связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Реакция торможения гемагглютинации

(РТГА)

метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

3. Серологическое исследование позволяет поставить диагноз в случае обнаружения специфических антител в сыворотке больных. Для серологических реакций используют парные сыворотки, которые берут в первые дни от начала заболевания и спустя 1 - 3 недели, но изучают одновременно. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более. РТГА, РН, РСК, РТГадс, РИФ, РИА, ИФА ставят с антигенами (диагностикума-ми), приготовленными из эталонных штаммов соответствующих вирусов.

4. Парные - это значит, что кровь дважды берут с каким-то интервалом времени. По нарастанию титра антител определяют, что заражение произошло. Если титр антител не меняется, значит, эти антитела в организме уже давно, свежего заражения нет.

Наибольшую диагностическую ценность представляет исследование парных сывороток, взятых от животных в начале и в конце заболевания (с промежутком в 14-21 день). Сыворотку отбирают в стерильные пробирки и хранят для исследования.

Описание

Набор для диагностики парвовирусной болезни свиней предназначен для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов в реакции гемагглютинации (РГА) и специфических антител в сыворотке крови свиней, а также новорожденных поросят (до приема молозива) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Реакцию ставят микрометодом в лунках полистироловых пластин. полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций; антиген специфический инактивированный, обладающий гемагглютинирующей активностью не ниже 1:128; сыворотка специфическая, обладающая активностью в РТГА не ниже 1:256; сыворотка нормальная (отрицательный контроль).

Время проведения анализа:

РГА – 2,5-3,5 часа, РТГА – 3,5-4,5 часа (не учитывая время подготовки материалов для исследования).

Принцип метода:

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на склеивании взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием гемагглютинирующих свойств вируса и образования рыхлого осадка в виде зонтика. Сущность РТГА заключается в нейтрализации гемагглютинирующих свойств вируса специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови, в результате чего не происходит склеивания эритроцитов и они оседают на дно, образуя плотный осадок в виде пуговки.

Условия хранения

Набор хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. После растворения компоненты набора можно хранить в замороженном состоянии в течение 1 месяца, повторное замораживание не допускается.

Срок годности

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки. Реакцию агглютинации можно проводить в микроварианте в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических исследований с коническим дном. В лунки планшета вносят по 0,05 мл ФСБ (рН 7,2-7,4) и готовят двукратные разведения испытуемых сывороток крови от 1:2 и выше. Затем в каждую ячейку вносят по 0,005 мл суспензии грибных клеток в концентрации 100 тыс. грибных клеток в 1 мл. Планшет осторожно встряхивают и выдерживают 2 часа в термостате при 37°С, а затем 16-18 часов - при 4°С. В качестве отрицательного контроля используют нормальную (негативную) сыворотку крови и ФСБ. Результаты реакции учитывают с помощью микроскопа и визуально и определяют в крестах по следующей схеме: (++++) - полное просветление жидкости и образование агглютината на дне лунки в виде перевернутого "зонтика", при встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья; (+++) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик"; (++) - заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен умеренно; (+) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен слабо; (-) - отрицательный результат, просветление жидкости не наступило, на дне лунки осадок в виде пуговки, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь. За титр антител принимали последнее разведение испытуемой сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в два креста (++).

реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

В основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куринных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови.

Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов.

Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25 - 1% взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками.

РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двухкратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус и по одной капле 1% взвеси эритроцитов.

При использовании РТГА для определения типа вируса, используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.

РГА и РТГА широко применяется для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ–АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис. 48). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод – на поэтапном выявлении комплекса АГ–АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап – в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ – простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

РИА – один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В, у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1-2 сут при температуре 40 0 С, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом 125 J) и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 49). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченным антигеном и, поэтому, он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченного антигена с активными центрами антител.

Иммуноферментный метод (ИФА)

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, b-галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 50).

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем – смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

РАЗДЕЛ VII. ОСНОВЫ ВИРУСОЛОГИИ